La restricción de azúcar y la ingestión de sangre dan forma a trayectorias de defensa inmune divergentes en el mosquito Aedes aegypti

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12368 (2023) Citar este artículo

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La defensa inmune se compone de (1) resistencia: la capacidad de reducir la carga de patógenos, y (2) tolerancia: la capacidad de limitar la gravedad de la enfermedad inducida por una carga de patógenos determinada. El estudio de la tolerancia en el campo de la inmunidad animal es bastante incipiente en comparación con la resistencia. En consecuencia, los estudios que examinan la defensa inmune de manera integral (es decir, considerando tanto la resistencia como la tolerancia en conjunto) son poco comunes, a pesar de su exigencia de lograr una comprensión profunda de la defensa inmune. Además, comprender la tolerancia en los vectores de enfermedades artrópodos es excepcionalmente relevante, ya que la tolerancia es esencial para la transmisión cíclica de patógenos por parte de los artrópodos. Aquí, probamos los efectos de la concentración de sacarosa en la dieta y la ingestión de sangre sobre la resistencia y la tolerancia a la infección por Escherichia coli en el mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti. La resistencia y la tolerancia se midieron simultáneamente y en múltiples momentos. Descubrimos que los mosquitos del tratamiento con azúcar restringido mostraron una mayor resistencia en todos los momentos posteriores a la infección en comparación con los del tratamiento con azúcar estándar de laboratorio. La sangre también mejoró la resistencia, pero sólo en las primeras etapas posteriores a la infección. Si bien la restricción de sacarosa no tuvo ningún efecto sobre la tolerancia, demostramos que el consumo de sangre antes de la infección bacteriana mejora la disminución temporal de la tolerancia que experimentan los mosquitos cuando se les proporciona únicamente comidas azucaradas. En conjunto, nuestros hallazgos indican que diferentes componentes dietéticos pueden tener impactos únicos y, a veces, temporalmente dinámicos sobre la resistencia y la tolerancia.

La respuesta de un organismo a la infección (es decir, defensa inmune) se compone tanto de resistencia como de tolerancia1,2. La resistencia se define como la capacidad de reducir la cantidad de patógenos dentro del cuerpo, mientras que la tolerancia se define como la capacidad de limitar el impacto de la infección en la aptitud del huésped. Ambas estrategias son fundamentales para sobrevivir a la infección. La resistencia y la tolerancia fueron conceptualizadas por primera vez por los botánicos a finales del siglo XIX3, y desde entonces los biólogos vegetales han obtenido importantes conocimientos sobre la resistencia y la tolerancia. Por el contrario, los científicos que estudian huéspedes animales se han centrado desproporcionadamente en la resistencia hasta hace poco2,4,5. Como resultado, la tolerancia inmune en animales es un campo de estudio incipiente, pero en rápido desarrollo. Las estrategias de tolerancia probablemente incluyan tácticas como la reparación del daño tisular inducido por patógenos, la desintoxicación de subproductos de patógenos, la limitación de las autolesiones mediadas por la respuesta inmune (es decir, la inmunopatología) y la promoción de la homeostasis general durante y después de la infección. Todas ellas estrategias que promueven la salud del huésped sin necesariamente afectar los niveles de patógenos2,6,7,8,9. La inmunología ecológica postula que la resistencia y la tolerancia, como componentes de la defensa del huésped, son costosas y sólo deben emplearse cuando los beneficios superan los costos10. Por lo tanto, el equilibrio de un huésped entre resistencia y tolerancia probablemente sea importante desde una perspectiva de limitación de recursos, ya que un equilibrio inadecuado entre resistencia y tolerancia puede conducir a un resultado de infección indeseable. Por ejemplo, una fuerte respuesta de resistencia puede dar como resultado la eliminación completa del patógeno, pero tal resultado podría dejar reservas de energía inadecuadas para reparar los daños inducidos por la infección. Si esto resulta en una reducción de la aptitud reproductiva a lo largo de la vida, no sería una estrategia exitosa.

Si bien un equilibrio apropiado entre resistencia y tolerancia es importante en todos los sistemas huésped-patógeno, tiene una relevancia única en los artrópodos hematófagos que transmiten patógenos. Los patógenos transmitidos por artrópodos son muy diversos e incluyen virus, bacterias, parásitos protozoarios y filarias. Las enfermedades causadas por estos patógenos representan más del 17% de todas las enfermedades infecciosas mundiales11 y, por lo tanto, imponen una enorme carga para la salud pública y veterinaria. Los patógenos transmitidos por artrópodos son ingeridos por el artrópodo cuando se alimenta de sangre de un huésped vertebrado infectado. Debido a que la transmisión depende categóricamente de la capacidad del artrópodo para tolerar la infección el tiempo suficiente para propagar el patógeno a un huésped vertebrado posterior, estudiar la tolerancia inmune es fundamental para comprender y abordar la transmisión de patógenos transmitidos por artrópodos. Por lo tanto, exploramos el efecto de la dieta sobre la resistencia y la tolerancia a la infección simultáneamente en el mosquito de la fiebre amarilla, Ae. aegypti, que transmite múltiples patógenos humanos, incluidos el virus del dengue y el virus del Zika.

Los mosquitos adultos hembra han evolucionado para consumir dos tipos de alimentos: (1) néctar, que es rico en azúcar, y (2) sangre, que es rica en proteínas y necesaria para la producción de huevos en la mayoría de las especies12,13. El consumo, el almacenamiento y la digestión difieren apreciablemente entre los dos tipos de comidas. Por ejemplo, las harinas azucaradas se almacenan en el divertículo ventral (buche), mientras que las harinas de sangre pasan por alto el buche y se envían directamente al intestino medio. Las harinas azucaradas se pueden almacenar en el buche hasta que se necesiten para actividades que consumen mucha energía, como volar, mientras que la digestión de la sangre generalmente comienza a las pocas horas de la alimentación14. La digestión de la sangre, a diferencia de la digestión de sacarosa, también se asocia con un estrés fisiológico significativo debido a cambios rápidos en la temperatura y el pH, la distensión intestinal, la toxicidad del hemo resultante de la digestión de la hemoglobina y el estrés redox del intestino medio15,16,17,18,19,20,21.

Anteriormente se había implicado a la dieta en la defensa inmune de los artrópodos. Por ejemplo, se ha demostrado que concentraciones más bajas de azúcar en la dieta mejoran la resistencia a la infección bacteriana en Drosophila melanogaster y la resistencia a la infección por Plasmodium en Anopheles stephensi21,22. También se han explorado los efectos de la dieta sobre la tolerancia. Por ejemplo, el genotipo interactúa con la dieta para impactar la tolerancia a la infección bacteriana en D. melanogaster22. Además, un estudio que investigó los efectos de la ingesta de sangre sobre la infección bacteriana en Ae. aegypti descubrió que la sangre afecta la resistencia y la tolerancia en las primeras etapas de la infección, pero los efectos dependían de la dosis23. En el presente estudio, probamos los efectos de dos hembras adultas de Ae. aegypti, (1) sacarosa dietética estándar o restringida de laboratorio y (2) la ingestión de sangre, sobre la resistencia y tolerancia a la infección bacteriana. Medimos la resistencia y la tolerancia simultáneamente en múltiples momentos a lo largo de un curso de infección de 5 días, lo que nos permitió examinar la trayectoria de resistencia/tolerancia de cada grupo de tratamiento, así como probar cualquier posible interacción entre los dos componentes de la dieta del mosquito que afecte la defensa inmune. Nuestros resultados contribuyen a la comprensión de cómo los artrópodos de importancia médica resisten la infección bacteriana y, más específicamente, dilucidan los efectos de la alimentación con sangre y azúcar en la defensa inmune que pueden conservarse entre otros vectores artrópodos hematófagos.

Investigamos el efecto de la concentración de sacarosa en la dieta y la alimentación sanguínea sobre la resistencia y la tolerancia a las infecciones a lo largo del tiempo. Para lograr esto, expusimos la hembra Ae. aegypti a cuatro tratamientos dietéticos diferentes: 10% de sacarosa sola, 10% de sacarosa + harina de sangre, 1% de sacarosa sola y 1% de sacarosa + harina de sangre. Luego los infectamos con E. coli (S17) y medimos la carga bacteriana y la supervivencia en múltiples momentos posteriores a la infección (Fig. 1). El conjunto de datos resultante comprende siete variables (Tabla 1) y se utilizó para construir múltiples modelos que describen los efectos de la sangre y la sacarosa sobre la resistencia y la tolerancia a la infección bacteriana a lo largo del tiempo.

Esquema de diseño experimental. Criamos hembras adultas de Ae. aegypti con cuatro dietas experimentales: 10% de sacarosa sola, 10% de sacarosa + harina de sangre, 1% de sacarosa sola y 1% de sacarosa + harina de sangre. Luego infectamos a individuos con E. coli fluorescente (S17) mediante microinyección intratorácica. Los mosquitos infectados se dividieron en grupos de seguimiento para determinar su supervivencia y carga bacteriana. Las mediciones de supervivencia y carga bacteriana se obtuvieron en paralelo 1, 3 y 5 días después de la infección (dpi). El conjunto de datos resultante se utilizó para construir modelos que describieran los efectos de las dietas con sangre y/o sacarosa sobre la resistencia y la tolerancia simultáneamente (Tabla 1).

Medimos la resistencia a la infección bacteriana probando los efectos de la sacarosa y la sangre sobre la carga bacteriana 1, 3 y 5 días después de la infección (dpi). Primero construimos un modelo utilizando sacarosa, sangre y día como variables predictivas y carga bacteriana como variable de respuesta, luego evaluamos los efectos principales, así como todas las interacciones potenciales. Realizamos una eliminación hacia atrás para identificar términos significativos del modelo y encontramos que tanto la sacarosa (Tabla 2: Modelo A, p Sacarosa = 4,57 × 10–5) como el Día (Tabla 2: Modelo A, p Día = 2,92 × 10–4) afectan significativamente resistencia a la infección. Las hembras alimentadas con un 1% de sacarosa tuvieron cargas bacterianas significativamente más bajas (y por lo tanto una mayor resistencia) que las hembras alimentadas con un 10% de sacarosa, y la carga bacteriana disminuyó con el tiempo para ambos grupos de tratamiento (Fig. 2). Además, las comparaciones por pares entre los tratamientos con sacarosa en cada día individual mostraron que la exposición al 1% de sacarosa mejoró significativamente la resistencia a la infección en todos los días posteriores a la infección. (Tabla 3: Modelo B (Día 1), p Sacarosa = 0,008; Modelo C (Día 3), p Sacarosa = 0,005; Modelo D (Día 5), ​​p Sacarosa = 0,048).

Los mosquitos alimentados con un 1% de sacarosa tenían cargas bacterianas significativamente más bajas en comparación con los mosquitos alimentados con un 10% de sacarosa. Los diagramas de caja se construyeron utilizando cargas bacterianas medianas para hembras alimentadas con 1% de sacarosa y 10% de sacarosa a 1, 3 y 5 ppp. Cada valor mediano se calculó a partir de cuatro individuos y las barras de error de puntos muestran el rango intercuartílico. Los asteriscos representan diferencias significativas en la carga bacteriana entre los tratamientos con sacarosa en cada momento posterior a la infección (**p <0,01, *p <0,05). Los datos se recopilaron de un total de cinco experimentos replicados.

La alimentación con sangre también afectó significativamente la resistencia a la infección, pero solo a 1 ppp, momento en el que las hembras alimentadas con sangre tenían cargas bacterianas significativamente más bajas en comparación con las hembras no alimentadas con sangre (Tabla 3: Modelo B, p Sangre = 0,038; Fig. 3 ).

Los mosquitos alimentados con sangre tenían cargas bacterianas significativamente más bajas en comparación con los mosquitos no alimentados con sangre a 1 ppp. Los diagramas de caja se construyeron utilizando puntos trazados que muestran la carga bacteriana mediana (n = 4) para hembras alimentadas con sangre y no alimentadas con sangre a 1, 3 y 5 ppp. Cada valor mediano se calculó a partir de cuatro individuos y las barras de error de puntos muestran el rango intercuartílico. Los asteriscos representan diferencias significativas en la carga bacteriana entre los tratamientos con sacarosa en cada momento posterior a la infección (*p <0,05, ns = sin diferencia significativa). Los datos se recopilaron de un total de cinco experimentos replicados.

También probamos los efectos de la sangre y la sacarosa sobre la tolerancia a la infección, donde la tolerancia se midió a medida que la pendiente de supervivencia de la población retrocedía según la carga de patógenos24. Para comparar la tolerancia entre los grupos de tratamiento, determinamos la presencia o ausencia de un término de interacción estadísticamente significativo entre la carga bacteriana y una variable de tratamiento para predecir la supervivencia en un modelo determinado. La presencia de un término de interacción tan significativo indicaría que la relación entre Supervivencia y Carga Bacteriana cambia dependiendo del valor de la variable de tratamiento.

Primero construimos un modelo con Supervivencia como variable de respuesta y Carga bacteriana, Sangre, Sacarosa y Día como variables predictoras. Evaluamos los efectos principales, así como todas las interacciones potenciales, y realizamos una eliminación hacia atrás para lograr el modelo de mejor ajuste. El modelo final reveló una interacción significativa de tres vías entre sangre, carga bacteriana y día (Tabla 4: Modelo E; p Carga bacteriana × Sangre × Día = 0,006), lo que indica que: (1) la sangre altera significativamente la tolerancia y (2 ) el efecto cambia a lo largo del tiempo. Para examinar más de cerca la naturaleza del efecto dependiente del tiempo de la sangre sobre la tolerancia, analizamos nuestros datos por día y utilizamos los tres conjuntos de datos resultantes para construir un modelo de tolerancia para cada día (Fig. 4). Estos modelos de días específicos revelan que los mosquitos alimentados con sangre tenían una tolerancia significativamente menor a 1 ppp (Tabla 5: Modelo F, p Carga bacteriana × Sangre = 0,002), ninguna diferencia significativa a 3 ppp y una tolerancia significativamente mayor a 5 ppp (Tabla 5: Modelo G, p Carga bacteriana × Sangre = 0,040) en comparación con mosquitos no alimentados con sangre. Paralelamente, también probamos si la tolerancia cambia a lo largo del tiempo para los grupos de tratamiento alimentados con sangre y/o no alimentados con sangre. Para lograr esto, analizamos nuestro conjunto de datos por estado de alimentación con sangre y utilizamos los dos conjuntos de datos resultantes para construir un modelo de tolerancia para cada grupo de tratamiento de alimentación con sangre. Estos modelos revelaron que la tolerancia disminuyó significativamente con el tiempo en los mosquitos no alimentados con sangre (Tabla 6: Modelo H, p Carga bacteriana × Día = 6,70 × 10–6) pero no cambió significativamente en los mosquitos alimentados con sangre (Tabla 6: Modelo I).

El efecto de la alimentación sanguínea sobre la tolerancia varía con el tiempo. Los puntos muestran la supervivencia de la población frente a la carga bacteriana media en cada momento posterior a la infección. Las barras de error alrededor de los puntos muestran el rango intercuartílico de los cuatro valores utilizados para calcular los valores medios de la carga bacteriana. Las líneas trazadas se derivan de gráficos de interacción de medias marginales estimadas calculadas a partir de modelos de tolerancia binomial específicos de un día (Tabla 5: Modelo F (Día 1), pCarga bacteriana × Sangre = 0,002; Día 3, sin predictores significativos; Tabla 5: Modelo G ( Día 5), ​​pCarga bacteriana × Sangre = 0,040) representado en una escala de respuesta en lugar de una escala lineal. La presencia de líneas continuas indica pendientes significativamente diferentes y, por lo tanto, una diferencia significativa en la tolerancia entre los grupos de tratamiento sanguíneo en ese momento. Las líneas discontinuas no indican ninguna diferencia significativa en la tolerancia en ese momento. Los datos se recopilaron de un total de cinco experimentos replicados.

La sangre alteró la resistencia al principio de la infección y la tolerancia de forma dinámica a lo largo del curso de la infección. Por lo tanto, comparamos la utilización relativa de cada componente de la defensa inmune trazando cuantitativamente la resistencia y la tolerancia para cada grupo de estado de alimentación de sangre en los tres momentos (Fig. 5). Los mosquitos alimentados con sangre mostraron un aumento en la resistencia (Tabla 2: Modelo A, p Día = 2,92 × 10–4) y una tendencia no significativa hacia una mayor tolerancia (Tabla 6: Modelo I) de 1 a 5 ppp, mientras que no los mosquitos alimentados con sangre mostraron una mayor resistencia (Tabla 2: Modelo A, p Día = 2,92 × 10–4) pero una menor tolerancia (Tabla 6: Modelo H, p Carga bacteriana × Día = 6,70 × 10–6) de 1 a 5 ppp (Figura 5).

La alimentación con sangre altera la trayectoria de resistencia y tolerancia del mosquito con el tiempo. Los puntos trazados muestran el equilibrio de tolerancia y resistencia a lo largo del tiempo de infección para mosquitos alimentados con sangre (panel izquierdo) y no alimentados con sangre (panel derecho). Para estimar la tolerancia, hicimos una regresión de la carga bacteriana en la supervivencia por separado para cada combinación de estado de alimentación de sangre/día y encontramos la media marginal estimada y el error estándar de la carga bacteriana para cada modelo utilizando el paquete emmeans111. La resistencia es la mediana de la población de UFC con rangos intercuartílicos para cada grupo representados en una escala del eje x invertida (ya que la resistencia está inversamente relacionada con las UFC). Los datos se recopilaron de un total de cinco experimentos replicados.

Hemos demostrado que una dieta con un 1% de sacarosa confiere una mayor resistencia a la infección intratorácica por la bacteria gramnegativa E. coli S17 en hembras adultas de Ae. aegypti (cepa tailandesa) en comparación con una dieta con 10% de sacarosa. En los mosquitos, los efectos de los azúcares de la dieta sobre la respuesta a la infección se han estudiado principalmente utilizando modelos de infección oral. En un estudio, la alimentación con azúcar antes de la infección mejoró la infección por Ae. aegypti resistencia al Zika al aumentar la expresión de genes antivirales25, mientras que en An. stephensi, una menor abundancia de glucosa en la dieta se correlacionó con una mayor resistencia a Plasmodium berghei21. En D. melanogaster, una menor concentración de azúcar en la dieta aumentó la resistencia a la infección bacteriana en dos estudios separados22,26. En conjunto, el trabajo actual sugiere que los niveles más bajos de azúcar en la dieta generalmente se correlacionan con una mayor resistencia a las infecciones, lo cual es consistente con nuestros hallazgos.

Si bien la sacarosa en la dieta afectó significativamente la resistencia de los mosquitos en nuestro estudio, no afectó la supervivencia (S1 Fig). Por el contrario, se han observado efectos del azúcar en la dieta sobre la supervivencia en D. melanogaster, aunque la direccionalidad del efecto no es consistente. Howick y Lazzaro22 demostraron que un mayor nivel de azúcar en la dieta se asociaba con una menor supervivencia (y una menor resistencia) después de la infección. Sin embargo, otros estudios han demostrado una relación positiva entre el azúcar en la dieta y el resultado de la infección (aunque la resistencia no se midió directamente). Por ejemplo, en un estudio, las moscas que consumían una dieta relativamente baja en proteínas y rica en carbohidratos mostraron una mayor supervivencia a la infección bacteriana y una mayor expresión constitutiva de péptidos antimicrobianos (AMP)27. En otro estudio, la suplementación con glucosa en la dieta mejoró significativamente la longevidad y la supervivencia de D. melanogaster después de una infección bacteriana28. Múltiples diferencias entre estos estudios y el nuestro, incluido el diseño experimental y el tipo de patógeno, podrían subyacer a los diferentes hallazgos. En general, las relaciones entre los azúcares de la dieta y la supervivencia después de la infección no son totalmente consistentes y justifican más estudios.

Se desconocen los mecanismos por los cuales el azúcar afecta la resistencia. Como se sabe que la dieta afecta la composición de la hemolinfa en los insectos29,30, un mayor contenido de azúcar en la dieta puede proporcionar un entorno más adecuado para que proliferen las bacterias. Alternativamente, pero no mutuamente excluyente, una concentración más baja de sacarosa en la dieta puede afectar directa o indirectamente la señalización de las vías inmunes del mosquito, inhibiendo así mecanismos de resistencia como la melanización, la producción de AMP y/o la actividad de los hemocitos. Los niveles más altos de azúcar en la dieta se asocian con una respuesta de melanización más fuerte en los mosquitos31,32,33, lo que inicialmente puede parecer contrario a nuestros resultados. Sin embargo, los mosquitos fagocitan preferentemente a E. coli en lugar de melanizarla34,35,36, lo que sugiere que es poco probable que cualquier reducción en la melanización que pueda haber ocurrido en el tratamiento con sacarosa al 1% afecte los resultados de la infección en nuestro sistema. La sacarosa puede tener un efecto diferente después del desafío con un patógeno que está principalmente melanizado. En D. melanogaster, las diferencias en los niveles de azúcar en la dieta están asociadas con cambios fisiológicos que pueden explicar los efectos sobre la resistencia. Por ejemplo, las moscas criadas con dietas ricas en azúcar muestran una morfología anormal de los hemocitos, defectos en la capacidad de fagocitosis y una activación excesiva de Toll/JNK en el cuerpo graso37. Otro trabajo también ha implicado a las dietas altas en azúcar en la inhibición de la señalización FOXO en D. melanogaster38, que ha demostrado ser crítica en la resistencia a la infección bacteriana39.

Las dietas de sacarosa proporcionadas a los mosquitos en este laboratorio no son representativas de las harinas azucaradas obtenidas en el campo. El comportamiento de alimentación de los mosquitos con azúcar en entornos naturales no se comprende completamente; sin embargo, la evidencia sugiere que los mosquitos pueden obtener azúcar en entornos naturales alimentándose de néctar floral, néctar extrafloral, melaza, savia de árboles, frutas podridas, basura de caña de azúcar e incluso desechos domésticos ricos en azúcar12,14. La composición de las comidas azucaradas que consumen los mosquitos en entornos naturales es bastante variable. Por ejemplo, las harinas de néctar floral generalmente incluyen una variedad de azúcares diferentes, mientras que los desechos domésticos pueden contener sustancias no naturales como jarabe de maíz con alto contenido de fructosa o concentrados de jugo de frutas. En el presente estudio, hemos explorado dos concentraciones de un tipo de azúcar de forma aislada. Se necesitan más estudios para determinar los efectos de las concentraciones de azúcar o de diferentes tipos de azúcar sobre la resistencia y la tolerancia a las infecciones.

Si bien las diferencias en la resistencia inmune entre nuestros tratamientos con sacarosa pueden explicarse por el efecto de la disponibilidad de sacarosa en la dieta per se, también es factible que el efecto que observamos sea el resultado de la restricción calórica general. Los insectos sujetos a restricción alimentaria y los insectos sujetos a infección experimentan muchos de los mismos cambios fisiológicos, incluida la reconfiguración del metabolismo intermedio, la reducción del almacenamiento de energía, la liberación de glucosa y ácidos grasos de las reservas de energía existentes y la inhibición de la vía de señalización similar a la insulina40,41 . En virtud de estos puntos en común, la restricción de alimentos antes de la infección puede inducir un cambio metabólico que prepara funcionalmente al mosquito para resistir la invasión de patógenos. De hecho, en términos más generales, se han observado efectos positivos de la inanición o la restricción dietética sobre la resistencia y/o el resultado de la infección en múltiples órdenes de insectos42,43,44,45,46,47. Sin embargo, la inanición impuesta no siempre conduce a un aumento de la resistencia y, en muchos casos, se ha demostrado que causa una disminución de la resistencia y/o resultados adversos de infección44,48,49,50,51,52. Por ejemplo, los escarabajos hambrientos Leptinotarsa ​​decemlineata muestran una mayor susceptibilidad a Beauveria bassiana y una mayor mortalidad post-infección en comparación con sus homólogos no hambrientos49. De manera similar, la mosca tsetsé Glossina morsitans morsitans muestra una mayor susceptibilidad tanto al Trypanosoma congolense como al Trypanosoma brucei brucei en condiciones de inanición50. Los efectos del hambre en la respuesta a la infección no son uniformes entre los taxones. Estas diferencias pueden explicarse por una variedad de factores como el tipo de patógeno, la dosis del patógeno, la ruta de infección o las idiosincrasias del historial de vida del huésped, pero se necesitan más estudios para comprender la relación entre la inanición y la defensa inmune.

Nuestros datos también revelan que una ingesta de sangre mejora la resistencia a 1 ppp. Esto difiere del efecto de la sacarosa, que sigue siendo significativo en cada momento medido. Trabajos anteriores informaron efectos similares de la alimentación sanguínea sobre la resistencia a E. coli, en asociación con la señalización de la insulina en un caso23 y con la 20-hidroxiecdisona (20E) en otro53. Además de respaldar estos hallazgos, nuestros datos contribuyen a una mejor comprensión de la naturaleza dinámica del efecto de la sangre a lo largo del tiempo. Específicamente, el efecto de la sangre sobre la resistencia es relativamente transitorio, especialmente en comparación con el efecto de la sacarosa dietética sobre la resistencia bacteriana, que es constante durante al menos cinco días después de la infección. Como el efecto de la sangre sobre los títulos de 20E generalmente no se extiende más allá de las 48 h posteriores a la ingesta de sangre54,55, el 20E puede aumentar la resistencia en los mosquitos (Reynolds et al.53; pero véanse Wang et al.56; Werling et al.57), Es posible que el efecto dinámico de la alimentación sanguínea sobre la resistencia que observamos se deba al cambio de los títulos de 20E con el tiempo. Los títulos de otra hormona, la hormona juvenil (JH), disminuyen rápida y drásticamente en Ae. aegypti, alcanzando mínimos entre 24 y 48 h después de la ingesta de sangre58,59. JH y los análogos de JH están asociados con diversos efectos inmunosupresores, incluida la regulación negativa de los genes AMP60,61,62, la disminución de la actividad de las moléculas activadoras de hemocitos63 y las reducciones en la actividad de la fenoloxidasa64,65. Por lo tanto, también es factible que la mejora de la resistencia después de la alimentación con sangre esté mediada por la disminución de JH. Además del posible papel regulador de las hormonas, las investigaciones sobre el perfil transcripcional del mosquito después de la alimentación con sangre indican una expresión alterada de genes relacionados con el sistema inmunológico dentro de las 24 h posteriores a la ingesta de sangre66,67,68,69. Dichos genes pueden afectar la resistencia a la infección bacteriana y pueden o no estar sujetos a regulación por la señalización de la insulina y/u hormonas como JH y 20E.

Si bien el efecto de la sangre sobre la resistencia se limita a 1 ppp, observamos un efecto dinámico de la alimentación con sangre sobre la tolerancia a lo largo del transcurso de la infección de 5 días. Los mosquitos alimentados con sangre tienen una tolerancia significativamente menor en comparación con los mosquitos no alimentados con sangre a 1 ppp, y una tolerancia significativamente mayor a 5 ppp. Además, los mosquitos no alimentados con sangre muestran una disminución significativa en la tolerancia a lo largo de un período de infección de 5 días, mientras que los mosquitos alimentados con sangre muestran una tolerancia estática a lo largo de un período de infección de 5 días. Esto sugiere que la ingesta de sangre mejora la disminución de la tolerancia que experimentan los mosquitos cuando se les suministra únicamente alimentos azucarados. La sangre es un recurso nutricional único: su digestión está asociada con diversos factores estresantes fisiológicos, incluidos cambios rápidos de temperatura y pH15,70, así como toxicidad del hemo y estrés oxidativo71,72,73. A pesar de los desafíos que plantea la digestión de la sangre, los mosquitos están bien adaptados para superar los factores estresantes asociados15,17,70,74,75. Debido a que muchos factores estresantes asociados con la alimentación con sangre también están asociados con la infección20,21,76,77, es posible que los procesos que promueven la homeostasis que ocurren durante o después de la alimentación con sangre tengan el efecto adicional de promover la salud del huésped durante la infección (es decir, tolerancia).

La alimentación con sangre induce múltiples cascadas de señalización que pueden promover la tolerancia a las infecciones. Por ejemplo, las proteínas de choque térmico (HSP) están ampliamente conservadas tanto en eucariotas como en procariotas78 y están implicadas en una variedad de procesos generalmente relacionados con la reducción del estrés79. Se inducen rápidamente al alimentarse de sangre en múltiples artrópodos y son fundamentales para sobrevivir al estrés de una ingesta de sangre15,19,80. Las HSP del huésped también han estado implicadas en la respuesta del huésped a infecciones bacterianas, virales y fúngicas, desempeñando funciones en la homeostasis mediante el mantenimiento de la estabilidad y funcionalidad de las proteínas, la reducción de la inflamación y la atenuación de la autoinmunidad81,82. Las HSP que protegen a los artrópodos del daño inducido por la sangre también pueden promover la salud y la supervivencia del huésped durante la infección. Además, la respuesta de la proteína desplegada (UPR) es una vía igualmente altamente conservada que mitiga el estrés y que ha estado fuertemente implicada en la defensa contra patógenos (revisado por Rosche et al.83). La regulación positiva transitoria de la UPR ocurre después de la alimentación de sangre en Ae. aegypti84. Además, la regulación positiva de la UPR promueve la tolerancia a Pseudomonas aeruginosa en el nematodo Caenorhabditis elegans85. También promueve la supervivencia en células de mosquitos infectadas con el virus del dengue in vitro al mejorar el estrés del retículo endoplásmico inducido por la infección86, una función que es característica de la tolerancia. Es importante destacar que es poco probable que una única vía de señalización o cascada molecular regule la tolerancia a la infección, ya que la inmunopatología afecta varios procesos fisiológicos1 que requieren reparación o protección. Por lo tanto, si los procesos antes mencionados efectivamente afectan la tolerancia, probablemente lo hagan en conjunto con otros mecanismos.

También es posible que el beneficio de tolerancia de una ingesta de sangre se explique por la afluencia de nutrientes (por ejemplo, proteínas, lípidos) asociados con la ingesta de sangre. Sin embargo, no observamos ningún efecto de la sacarosa sobre la tolerancia, y las concentraciones más altas de sacarosa en la dieta también están fuertemente asociadas con mayores reservas de nutrientes. Los homogeneizados de cuerpo entero de mosquitos alimentados con un 10% de sacarosa tienen niveles significativamente más altos de azúcar, glucógeno y lípidos en comparación con los mosquitos alimentados con un 2% de sacarosa87. Esto indica que si la tolerancia está realmente regulada nutricionalmente en nuestro sistema, esta regulación puede ser específica de los nutrientes proporcionados por la ingesta de sangre.

Los mosquitos alimentados con sangre y los no alimentados con sangre mostraron estrategias de resistencia-tolerancia marcadamente diferentes para sobrevivir a la infección con una bacteria no coevolucionada (Fig. 5). En ausencia de una ingesta de sangre, un mosquito muestra un aumento en la resistencia y una disminución en la tolerancia a lo largo de un curso de infección de cinco días. Pero cuando se le suministra sangre, la infección temprana se caracteriza por una respuesta de resistencia significativamente más fuerte y una respuesta de tolerancia significativamente más débil (posiblemente el resultado de una compensación). Con el tiempo, los mosquitos alimentados con sangre no muestran cambios en la tolerancia y un aumento en la resistencia similar al de los mosquitos que no se alimentan de sangre. Al comparar los grupos al final del curso de la infección, los mosquitos alimentados con sangre muestran igual resistencia y mayor tolerancia en comparación con los mosquitos no alimentados con sangre. Cada dieta indujo claramente una estrategia de defensa inmune única. Curiosamente, no observamos diferencias significativas en la supervivencia (S1 Fig), lo que indica que las dos estrategias empleadas por los grupos son igualmente efectivas para sobrevivir a la infección. No detectamos interacciones estadísticamente significativas entre la sacarosa y la sangre en nuestros modelos, lo que indica que los efectos de la sangre sobre la resistencia, la tolerancia y la supervivencia no difirieron entre los grupos con 1% de sacarosa y 10% de sacarosa. Sin embargo, es posible que regímenes alternativos de sacarosa (por ejemplo, una concentración de sacarosa superior al 10% o la ausencia total de cualquier alimento azucarado) no probados en este documento puedan alterar el efecto de la sangre.

Una ingesta de sangre no sólo es fisiológicamente estresante y energéticamente costosa de digerir por sí sola88, sino que también cataliza procesos reproductivos (es decir, vitelogénesis) que son energéticamente costosos89. La defensa inmune también es un proceso costoso10,90,91,92. Comprender cómo los organismos dividen los recursos limitados entre procesos que consumen mucha energía representa un desafío continuo en biología. Se ha demostrado que la reproducción, la inmunidad y la digestión se compensan fisiológicamente en múltiples sistemas de insectos89,93,94,95,96,97,98,99. A la luz de esto, puede resultar algo sorprendente que los mosquitos sometidos al estrés combinado de la digestión de la sangre, la reproducción y la infección en paralelo no muestren diferencias en la supervivencia en comparación con los mosquitos no alimentados con sangre. En general, nuestros resultados sugieren que los beneficios de la defensa inmune de una ingesta de sangre son lo suficientemente grandes como para mitigar los factores estresantes y el uso de recursos asociados con esta comida.

En el presente estudio, mostramos los efectos de la ingestión de sangre y dos concentraciones de sacarosa en la dieta sobre la resistencia y la tolerancia a la bacteria no coevolucionada E. coli en el mosquito hembra adulto de la fiebre amarilla Ae. aegypti. Nuestros resultados indican que la concentración de sacarosa en la dieta y la ingestión de sangre afectan la resistencia, mientras que solo la ingestión de sangre afecta la tolerancia. El efecto de la sangre sobre la tolerancia fue dinámico a lo largo del tiempo, empeorando significativamente la tolerancia al comienzo del curso de la infección y mejorando significativamente la tolerancia al final. Los mosquitos son uno de los muchos artrópodos que transmiten patógenos en virtud de un estilo de vida hematófago: mosquitos, garrapatas, mosquitos picadores, triatominos, pulgas, moscas negras y flebótomos transmiten patógenos cuando consumen sangre de vertebrados100. Asimismo, todos comparten la capacidad de tolerar los patógenos que transmiten, lo cual es fundamental para una transmisión exitosa. En vista de esto, la motivación para explorar la relación entre la hematofagia y la tolerancia no se limita a los mosquitos, sino que es ampliamente relevante en todos los sistemas patógenos transmitidos por artrópodos. Nuestro estudio se centró en la infección bacteriana introducida por una herida séptica; También se necesita trabajo adicional para investigar el papel de la dieta en la tolerancia a la infección por patógenos orales o verticales y proporcionaría una visión crítica sobre la generalización de nuestros hallazgos. Las características compartidas de la biología de la tolerancia entre especies de artrópodos, modos de infección o tipos de patógenos podrían aprovecharse como objetivos novedosos para un control de vectores eficaz y sostenible101. Debido a que la alimentación con sangre ya es una de las áreas mejor descritas de la biología de los mosquitos, ha sido investigada102,103,104,105 e implementada106 como objetivo de control de vectores y afecta la tolerancia en Ae. aegypti, centrarse en la alimentación sanguínea en el contexto del control de vectores centrado en la tolerancia tiene un potencial excelente.

Durante toda la duración del experimento, Ae. Se criaron mosquitos de la cepa Thai aegypti (Laura C. Harrington, Universidad de Cornell) en una cámara mantenida a 27 °C y 80% de humedad relativa en un ciclo de luz:oscuridad de 14 h:10 h. Primero, los huevos se incubaron en agua RO (ósmosis inversa) colocada en una cámara de vacío. Al eclosionar, las larvas se criaron en bandejas que contenían agua RO a una densidad de 200 a 300 larvas por bandeja y se les dio una pizca de copos de pescado Tetramin, así como comida para gatos ad libitum hasta la pupa. Tras la pupa, las copas de pupa se dividieron en cuatro jaulas de tratamiento de malla de 8" × 8" (Bioquip, Rancho Dominguez, CA, EE. UU.): 10% de sacarosa solamente, 10% de sacarosa + sangre, 1% de sacarosa solo y 1% de sacarosa + sangre. . Cada jaula recibió la harina de sacarosa adecuada al mismo tiempo que se añadían las copas de pupa. A las pupas se les asignaron 48 h para cerrar antes de retirar la copa pupal. Después de la eclosión, todos los adultos permanecieron tranquilos durante 48 h y luego murieron de hambre durante 24 h. A continuación, a los mosquitos de jaulas que contenían tratamientos de alimentación con sangre se les proporcionó una alimentación de sangre mantenida a 37 °C a través de un sistema de alimentación de membrana (Hemotek, Blackburn, Reino Unido) durante 1 a 2 h. Luego se devolvieron las comidas de sacarosa a todos los mosquitos. Las infecciones se realizaron en hembras 24 h después de la alimentación con sangre. En ese momento, el estado de alimentación de sangre se confirmó visualmente bajo un microscopio por la presencia de un bolo de sangre.

Los mosquitos se mantuvieron con una de cuatro dietas experimentales: 10% de sacarosa sola, 10% de sacarosa + sangre, 1% de sacarosa sola y 1% de sacarosa + sangre. Las harinas de sacarosa se crearon pasando una solución de agua DI (desionizada) y sacarosa UltraPure (Life Technologies, Carlsbad, CA) a través de un filtro de 0,2 µm. Las comidas de sangre consistieron en sangre de conejo desfibrinada (Hemostat, Dixon, CA, EE. UU.) suplementada con Na2ATP a una concentración de 1 mM.

La bacteria utilizada para las infecciones, E. coli S17 pPROBE-mCherry (Dimopoulos Lab, datos no publicados), contiene un plásmido mCherry fluorescente y un casete de resistencia a kanamicina. Las bacterias se cultivaron en caldo Luria (LB) suplementado con kanamicina (50 µg/ml) durante la noche a 30 °C con agitación. Los cultivos se lavaron tres veces en PBS 1X estéril, luego se sedimentaron y se resuspendieron a OD600 = 1 ± 0,1 (media de 1,23 × 9 UFC/ml en todas las réplicas). En el momento de la infección, los mosquitos fueron anestesiados en hielo y a las hembras se les inyectaron 69 nanolitros de una dilución 1 × 10–2 de este cultivo perforando el tejido blando de la hendidura anepisternal del mesotórax utilizando un inyector de nanolitro automático Nanoject II ( Drummond, Broomall, Pensilvania, EE. UU.). Se prepararon agujas de inyección nuevas para cada réplica tirando manualmente de un tubo capilar de vidrio de borosilicato (Drummond, Broomall, PA, EE. UU.) sobre una llama para lograr una punta con un diámetro exterior no superior a 500 micrones, medido con un micrómetro de platina. Los experimentos preliminares indicaron que la administración de bacterias de Nanoject II fue adecuadamente precisa, entregando una media de 312 ± 13 UFC por mosquito (se inyectaron n = 6 mosquitos, luego cada homogeneizado se cultivó inmediatamente como se describe en la sección siguiente) (Archivo S1). Después de la infección, los mosquitos de cada grupo de dieta se asignaron aleatoriamente en dos grupos y se colocaron en jaulas separadas para medir la supervivencia y la carga bacteriana.

La supervivencia y la carga bacteriana se midieron los días 1 (24 h +/– 2 h), 3 (72 h +/– 2 h) y 5 (120 h +/– 2 h) después de la infección. Inmediatamente después de la recopilación de datos en cada momento, los individuos muertos se retiraron de las jaulas de supervivencia y de carga bacteriana y se descartaron. La supervivencia se controló contando el número de mosquitos vivos y muertos. Para medir la carga bacteriana, se tomaron muestras de cuatro mosquitos vivos utilizando un aspirador InsectaVac (Bioquip, Rancho Dominguez, CA, EE. UU.) y se homogeneizaron individualmente en 150 µl de PBS 1X estéril. Se realizaron diluciones en serie a 10–2 y 10–4 y se cultivaron junto con un homogeneizado sin diluir en LB suplementado con kanamicina (50 µg/ml) a 30 °C durante 24 a 48 h. Las colonias fluorescentes resultantes se contaron utilizando un sistema adaptador de fluorescencia para microscopio estereoscópico (Nightsea, Lexington, MA). Para cada individuo, se utilizó la placa menos diluida con UFC contables para obtener un valor representativo. Después de obtener un recuento de UFC para cada mosquito individual, se calculó y utilizó en el conjunto de datos la mediana de cuatro mosquitos. Cada fila del conjunto de datos (Conjunto de datos S1) contiene la mediana de UFC de cuatro mosquitos junto con el valor de supervivencia adjunto para ese grupo de tratamiento.

Todos los análisis se realizaron utilizando el software estadístico R107 y RStudio108.

Para medir la resistencia, construimos modelos lineales que prueban los efectos de la sangre, la sacarosa, el día y la réplica sobre la carga bacteriana (Tabla 1). Se utilizó la eliminación hacia atrás para evaluar todas las interacciones posibles, así como los efectos principales. La presencia de cualquier efecto principal indica que la variable afecta significativamente la resistencia.

Para medir la tolerancia, utilizamos un enfoque de norma de reacción24 para probar la variación en la salud en un rango de cargas bacterianas en tiempo real entre grupos de dieta en múltiples momentos. Por lo tanto, nuestro enfoque se clasifica como tolerancia de rango en lugar de tolerancia puntual109. Construimos modelos lineales generalizados binomiales que prueban los efectos de la sangre, la sacarosa, el día y la carga bacteriana en la supervivencia (Tabla 1). Se utilizó la eliminación hacia atrás para evaluar todas las interacciones posibles, así como los efectos principales. Además, probamos todos los modelos de tolerancia para la sobredispersión110 realizando pruebas de bondad de ajuste de desviación residual y pruebas de bondad de ajuste de Pearson. Cuando se detectó, ajustamos la sobredispersión corrigiendo los errores estándar en esos modelos mediante la incorporación de un parámetro de dispersión al calcular la varianza. Los modelos con parámetros de sobredispersión se definen como modelos lineales cuasi generalizados que utilizan una distribución binomial donde la varianza viene dada por φ × μ, en la que μ es la media y φ el parámetro de dispersión. Utilizamos estos modelos finales para interpretar cualquier efecto de nuestras variables predictoras sobre la tolerancia. Específicamente, una interacción significativa entre la carga bacteriana y otra variable en la predicción de la supervivencia indica que esa variable afecta significativamente la tolerancia.

Para obtener gráficos de interacción de medias marginales estimadas para cada modelo de tolerancia binomial específico de un día (Fig. 4), utilizamos la función emmip del paquete emmeans111. Para obtener valores representativos de tolerancia para cada nivel de sangre en los días 1, 3 y 5 (Fig. 5), utilizamos la función emtrends del paquete emmeans, una función que crea una cuadrícula de referencia para cada modelo de interés y luego calcula cocientes de diferencias de predicciones de esas cuadrículas de referencia y calcula los promedios marginales y los errores estándar para esos promedios. Usamos la función emtrends para obtener estos valores para cada día usando el Modelo F (Día 1), el Modelo G (Día 5) y un modelo con un término Carga bacteriana × Sangre no significativo para el Día 3 (modelo no mostrado).

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria).

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Descargar referencias

Agradecemos a Ellen Klinger y Megan Meuti (Universidad Estatal de Ohio) por sus consejos estadísticos y comentarios útiles sobre el diseño experimental, a George Dimopoulos y Yuemei Dong (Universidad Johns Hopkins) por proporcionar la cepa de E. coli transformada con mCherry, así como a Laura C. Harrington (Universidad de Cornell) por el regalo de Ae. aegypti (cepa tailandesa).

Este trabajo fue financiado por el Instituto de Enfermedades Infecciosas de la Universidad Estatal de Ohio (https://idi.osu.edu/). Se proporcionó apoyo adicional para la investigación mediante fondos estatales y federales asignados a la Universidad Estatal de Ohio, la Facultad de Ciencias Alimentarias, Agrícolas y Ambientales (https://cfaes.osu.edu/), el Centro de Investigación y Desarrollo Agrícola de Ohio (https:// oardc.osu.edu/). Este material también se basa en el trabajo respaldado por el Programa de becas de investigación para graduados de la Fundación Nacional de Ciencias bajo la subvención n.° DGE-1343012. Cualquier opinión, hallazgo, conclusión o recomendación expresada en este material pertenece a los autores y no refleja necesariamente los puntos de vista de la National Science Foundation.

Departamento de Entomología, Facultad de Ciencias Alimentarias, Agrícolas y Ambientales, Universidad Estatal de Ohio, Columbus, OH, EE. UU.

Dom Magistrado, Noha K. El-Dougdoug y Sarah M. Short

Departamento de Botánica y Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad Benha, Benha, Egipto

Aunque K. El-Dougdoug

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DM y SMS concibieron las ideas, diseñaron la metodología y consiguieron financiación. DM y NKE recopilaron los datos. DM y SMS analizaron formalmente los datos y dirigieron la redacción del manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Sarah M. Short.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Magistrado, D., El-Dougdoug, NK & Short, SM La restricción de azúcar y la ingestión de sangre dan forma a trayectorias de defensa inmune divergentes en el mosquito Aedes aegypti. Representante científico 13, 12368 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39067-9

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Recibido: 01 de mayo de 2023

Aceptado: 19 de julio de 2023

Publicado: 31 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39067-9

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